GBP5探針法熒光定量PCR試劑盒使用手冊V1.0

本產品僅供科研，不得做其它用途

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本產品就是根據PCR原理專門開發的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

3. 產品精心優化且特異性高，引物是根據高度保守區設計，不會跟除此之外的其它微生物DNA發生交叉反應。

4. PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。

5. 本產品足夠50次20μL體系的PCR反應。

6. 本產品只能用于定性實驗，不能用于定量。

7. 本產品只能用于科研

GBP5探針法熒光定量PCR試劑盒使用手冊V1.0樣品的制備　

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

定義和原理

PCR 探針法試劑盒是基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術，結合探針來檢測特定核酸序列的工具包。其原理是在常規 PCR 基礎上，加入了一段能與目標核酸序列特異性結合的熒光標記探針。在 PCR 擴增過程中，當探針與目標序列結合后，通過熒光信號的變化來實時監測 PCR 產物的擴增情況。

主要組成成分

探針：帶有熒光基團和淬滅基團，在完整狀態下，淬滅基團抑制熒光基團的熒光信號。當探針與目標序列結合并被核酸酶切割后，熒光基團和淬滅基團分離，從而產生熒光信號。

DNA 聚合酶：負責在引物的引導下，將脫氧核苷酸（dNTPs）逐個添加到引物的 3' 端，合成新的 DNA 鏈。

dNTPs：即脫氧核苷三磷酸，包括 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，是合成 DNA 的原料。

反應緩沖液：為 PCR 反應提供適宜的 pH 值、離子強度等環境條件，保證 DNA 聚合酶的活性和反應的順利進行。

常見類型

TaqMan 探針法試劑盒：TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，其 5' 端標記熒光報告基團，3' 端標記淬滅基團。在 PCR 擴增過程中，Taq DNA 聚合酶的 5'-3' 外切酶活性會將與目標序列結合的探針切割，使熒光報告基團和淬滅基團分離，熒光信號增強。通過檢測熒光信號的強度，可以實時監測 PCR 產物的擴增情況。

分子信標探針法試劑盒：分子信標是一種具有發夾結構的寡核苷酸探針，其兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團。在沒有目標序列存在時，分子信標呈發夾結構，熒光報告基團和淬滅基團靠近，熒光信號被淬滅。當存在目標序列時，分子信標與目標序列雜交，發夾結構打開，熒光報告基團和淬滅基團分離，產生熒光信號。

2. 樣品制備

DNA提取：使用適合的DNA提取試劑he提取待測樣品中的DNA，確保DNA的純度和完整性。

樣品處理：樣品需在0-4℃條件下處理，避免RNA降解，并在實驗后立即檢測或儲存于-20℃。

3. 反應體系構建

反應管標記：根據實驗需求，標記N+9或N+4個PCR管，其中N為樣品數量，+9或+4分別用于標準曲線、陰性對照和陽性對照。

加入試劑：

每孔加入25μL反應體系，包括模板DNA、引物、探針、dNTPs、Taq酶等。

陽性對照和陰性對照分別加入不同濃度的標準品或無DNA的溶液。

4. PCR擴增

初始變性：95℃預變性3分鐘。

循環擴增：

溫度設置：95℃（變性）15秒，60℃（退火）30秒，72℃（延伸）1分鐘。

循環次數：通常為40次，每次循環后收集熒光信號。

熒光信號檢測：在60℃退火階段收集FAM通道的熒光信號，實時監控擴增過程。

5. 數據分析

定量分析：

繪制標準曲線：以陽性對照濃度的log值為橫軸，Ct值為縱軸，計算待測樣品的DNA濃度。

根據待測樣品的Ct值推算其濃度。

定性分析：

陰性對照無Ct值或Ct值≥40，陽性對照有典型擴增曲線且Ct值<40，待測樣品根據Ct值判斷陽性或陰性。

6. 結果驗證

必要時進行驗證實驗：如凝膠電泳檢測PCR產物大小，確保實驗結果的可靠性。

注意事項

實驗環境：實驗應在超凈工作臺或生物安全柜內進行，避免污染。

個人防護：佩戴一次性手套、口罩和無塵工作服，避免直接接觸試劑。

試劑保存：所有試劑需避光保存，避免反復凍融。

廢棄物處理：實驗后廢棄物需無害化處理

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