濃縮質(zhì)粒的異丙醇沉淀法

濃縮質(zhì)粒的異丙醇沉淀法

質(zhì)粒大抽后，通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右，可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。但是如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒。

加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇)，混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。

如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒，在洗脫時推薦采用1毫升洗脫液進(jìn)行洗脫，后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進(jìn)行異丙醇沉淀，這樣操作起來相對比較方便。

異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀，和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔，避免沉淀松動或部分顆粒狀懸浮至溶液中。

不推薦直接倒棄上清，直接倒棄上清時經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況；如果偏好直接倒棄上清，建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi)，這樣萬一沉淀被倒出，仍然可以從潔凈離心管中回收

。推薦用移液槍吸去上清，并注意盡量避免吸走沉淀。

加入1毫升常溫70%乙醇溶液，輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌，12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。

5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體，避免觸及沉淀。

肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥)，加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。

DNA樣品不能過于干燥，否則很難溶解。最好在弱堿性條件下溶解DNA，溶解時可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。