Exonuclease III試劑

Exonuclease III試劑來源于E.coli，具有3'-5'外切酶活性，它作用于雙鏈 DNA，從 3' OH 末端方向逐步切去單核苷酸；每次酶與底物

結(jié)合催化，只有幾個(gè)核苷酸被除掉，從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)缺失。該酶的最佳底物為平末端、5'突出末端雙鏈DNA分子

，但也可作用于雙鏈DNA的缺刻處，從3'降解DNA分子，釋放5'單核苷酸。對于3'突出末端，尤其是多于4nt的幾乎不切割,

 亦不能切割硫代磷酰脂鍵。核酸外切酶 III 的活性部分依賴螺旋結(jié)構(gòu)，并根據(jù)序列的不同而有差異（C＞A=T＞G）。另外，

核酸外切酶 III還具有脫嘌呤/嘧啶-核酸內(nèi)切酶活性、RnaseH活性和3' 磷酸酶活性。

組分

名稱數(shù)量

Exonuclease III (100 U/μl)50 μl

10X Exonuclease III Buffer1 ml

應(yīng)用

非定向巢式缺失

定點(diǎn)突變

鏈特異性探針的制備

制備用于雙脫氧測序的單鏈底模板

單位定義

50 μl 反應(yīng)體系中，37℃ 條件下，30 分鐘 催化E.coli DNA 產(chǎn)生 1 nmol 酸可溶性產(chǎn)物所需要的 量定義為一個(gè)活性單位。

1X Exonuclease III Buffer

10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10 mM MgCl2，1 mM DTT。

熱失活

70°C 20min。

儲(chǔ)存

置于-20°C，可保存3年。

Exonuclease III試劑試劑恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應(yīng)<20min(達(dá)平臺期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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