(T-GSH)檢測(cè)試劑盒(DTNB速率微板法)

動(dòng)物或植物細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)時(shí)，會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是一種生物體脂質(zhì)氧化

的天然產(chǎn)物，一些脂肪酸氧化后逐漸分解為一系列包括MDA在內(nèi)的復(fù)雜化合物，此時(shí)通過檢測(cè)MDA的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的

水平，因此MDA的測(cè)定被廣泛用作脂質(zhì)氧化的指標(biāo)。生物體內(nèi)的一些其它生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生MDA，

例如thromboxane synthase也可以催化產(chǎn)生，但只要在測(cè)定時(shí)設(shè)置適當(dāng)對(duì)照即可觀察到脂質(zhì)氧化水平的變化。

(T-GSH)檢測(cè)試劑盒(DTNB速率微板法)(Plant MDA Assay Kit with TBA)又稱脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒，

是采用一種基于MDA和硫酸(thiobarbituric acid, TBA)反應(yīng)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物的顯色反應(yīng)，隨后通過比色法用于對(duì)植物組織

(根、莖、葉、種子等)MDA進(jìn)行檢測(cè)，是專門用于植物脂質(zhì)氧化(lipid peroxidation)水平檢測(cè)的試劑盒，不適用于動(dòng)物組織

、細(xì)胞、血液等；丙二醛在較高溫度及酸性環(huán)境中可與TBA發(fā)生反應(yīng)，形成紅色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在532nm處有最大吸收，該復(fù)合物的吸光系數(shù)為155mmol/(L.cm)，并且在600nm波長(zhǎng)處有最小吸收，植物組織中糖類物質(zhì)對(duì)

MDA-TBA反應(yīng)有干擾，我們總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)公式，以消除這一干擾，亦可以通過比標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，進(jìn)行含量檢測(cè)。

該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

自備材料：

1、蒸餾水

2、電子天平、研缽或勻漿器、離心管或試管

3、低溫離心機(jī)、恒溫箱或水浴鍋、酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿，4℃ 10000r/min

離心15~20min，留取上清液，-20℃凍存，用于苯丙氨解氨酶的檢測(cè)。

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于苯丙解氨的檢測(cè)。

③細(xì)胞或組織樣品∶取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min，取上清液，

-20℃凍存，用于苯丙酸解氨酶的檢測(cè)。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙解氨酶，可以使用蒸餾水或PAL

Lysis Buffer稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板，按照下表設(shè)置對(duì)照孔、測(cè)定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并

注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置2平行孔，

求平均值。

加入物（μl）對(duì)照孔測(cè)定孔

蒸餾水150100

待測(cè)樣本5050

PAL Assay Buffer-50

3、PAL檢測(cè)︰

以對(duì)照孔為對(duì)照(調(diào)零)，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定孔的吸光度(記為   A測(cè)定0);40℃準(zhǔn)確孵育1h，立即加入10μl PAL終止

液終止反應(yīng)(備選方案)，以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定孔的吸光度(記為A測(cè)定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定

孔的吸光度。

注意事項(xiàng)∶

1、待測(cè)樣品中不能含有酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、獲得上清液為PAL酶液，應(yīng)盡快檢測(cè)，亦可-20°℃保存。

3、如果沒有可測(cè)定紫外區(qū)的酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板，也可以使用紫外分光光度計(jì)和石英比色皿，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測(cè)體積。

4、每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過多，否則操作時(shí)間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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