細(xì)胞培養(yǎng)基——影響細(xì)胞生長及存活

無論是原代培養(yǎng)還是細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)，一旦培養(yǎng)開始，就要定期更換培養(yǎng)基或“飼養(yǎng)"，如果細(xì)胞增殖。隨后遲早要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對干不增殖的培養(yǎng)物，也需要定期更換培養(yǎng)基，因?yàn)榧?xì)胞仍會(huì)代謝，培養(yǎng)基的某些成分會(huì)耗盡或自然降解細(xì)胞傳代間隔在不同細(xì)胞系中因生長速率和新陳代謝的不同而不同。快速生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，如 HeLa細(xì)胞系，通常每周傳代一次，四天后換液。生長緩慢的細(xì)胞系，特別是非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，可能每兩周、三周甚至四周傳代一次，兩次傳代之間每周換液。

有四個(gè)指標(biāo)表示需要更換培養(yǎng)基:

1.pH降低，要考慮pH降低的速率和確切值。當(dāng)pH從7.0降至6.5，大多數(shù)細(xì)胞停止生長；在pH6.5和6.0之間，細(xì)胞開始失去活性。如果培養(yǎng)基從紅色變成橙色，再變成黃色，那么需要更換培養(yǎng)基。盡量估計(jì)pH降低的速率；如果pH為7.0的培養(yǎng)物每天降低0.1pH單位，那么在換液前多放置一兩天沒什么傷害，但若培養(yǎng)物每天降低0.4pH單位，則需在24～48h 內(nèi)換液，不可不換液而放置過周末。

2.細(xì)胞濃度，細(xì)胞以高濃度培養(yǎng)比以低濃度培養(yǎng)更快地消耗培養(yǎng)基。pH變化速率能夠證明這一點(diǎn)，但也不總是如此。

3.細(xì)胞類型，正常細(xì)胞（例如二倍體成纖維細(xì)胞）通常在高密度時(shí)停止分裂，這一現(xiàn)象是由于細(xì)胞擁擠，生長因子耗盡及其他一些因素造成的。細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期，即使放置2～3周甚至更長時(shí)間，細(xì)胞也很少變性。然而，轉(zhuǎn)化細(xì)胞、連續(xù)細(xì)胞系以及一些胚胎細(xì)胞在細(xì)胞密度過高時(shí)迅速變性，除非每天換液或傳代。

4.形態(tài)衰退，這點(diǎn)需通過定期觀察和熟悉細(xì)胞系來預(yù)計(jì)。如果任其退化發(fā)展下去，它將成為不可逆的，細(xì)胞將會(huì)進(jìn)入凋亡。

通常培養(yǎng)基的體積與表面積比是0.2～0.5m/cm2。其上限由通過液體層的氣體擴(kuò)散所決定，而最適比例由該細(xì)胞的需氧量決定，需氧量高的細(xì)胞在軟淺的培養(yǎng)基中生長較好（如2mm），而需氧量較低的細(xì)胞在較深的培養(yǎng)基中生長較好（如5mm）。如果培養(yǎng)基的深度大于5mm，氣體擴(kuò)散會(huì)受到限制。對于單層培養(yǎng)物，這一問題可通過搖晃培養(yǎng)瓶，或以培養(yǎng)基灌注培養(yǎng)物并在一中間儲(chǔ)存器中進(jìn)行氣體交換來解決。

更換培養(yǎng)液時(shí)，即使細(xì)胞密度很高，也常伴隨細(xì)胞有絲分裂的激活。不需要激活有絲分裂時(shí)可使用維持培養(yǎng)基。維持培養(yǎng)基是將常規(guī)培養(yǎng)基血清濃度降至0.5%或2%或去除。因?yàn)闊o血清培養(yǎng)基中略去了生長因子和其他絲裂原。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系不適宜做這種處理，他們會(huì)繼續(xù)生長或者可能變性，因?yàn)檗D(zhuǎn)化細(xì)胞不會(huì)被調(diào)控在細(xì)胞周期的G1期停滯。