細胞培養(yǎng)中支原體污染的特點及檢驗

支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群 

或中央束。

支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數(shù)支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6-8．0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

支原體污染細胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。

為確定有無支原體污染可做如下檢測：

①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1-2min，向細胞面滴加pH5．5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。

④DNA分子條文檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較為復(fù)雜。

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養(yǎng)中生長，營養(yǎng)要求比細菌高。

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。國內(nèi)外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

組織細胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 β-內(nèi)酰胺類、萬古霉素等不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。