恒溫擴增技術發展現狀及未來趨勢

在這些恒溫擴增技術中，以2000年shou次報道的LAMP法尤為耀眼和引人關注，目前占據超過60%的恒溫檢測市場。核酸檢測對LAMP技術如此親賴，究其原因，得益于其它恒溫檢測技術難以達到LAMP技術的綜合性優勢：

1、反應速度極快，優化的引物組合可以達到15min內檢測到單copy分子，檢測速度接近或超過RPA和NASBA；

能夠達到超敏檢測極限，1-5copy的分子能夠穩定檢出，穩定性高，其它任何恒溫技術難以達到如此穩定的水平；

2、結果判讀形式的多樣化，適應各種環境和條件下的核酸快速檢測。LAMP擴增作為終點判讀形式，可不借助任何其它輔助設備，裸眼觀察檢出結果。基于鈣黃綠素、HNB、紅黃變色、OG橙綠變色都可以肉眼觀察結果。LAMP同樣可借助濁度儀進行實時濁度分析。在反應體系中加入SYBR Green熒光染料后，可使用小型恒溫熒光儀進行實時檢測。以上這些結果判讀形式均可在野外等非標準實驗室進行，所需設備簡單、小巧、價格低廉、便于普及。除此外，傳統實驗室中的熒光定量PCR儀，同樣可進行LAMP檢測，可采用SYBR Green、MB探針法或LAMP TaqMan探針法，對于經常操作PCR檢測的人員來講，可以無縫對接、無需更換設備。

3、對RNA病毒的漏檢率低，由于RNA病毒的突變率較高，在PCR檢測中個別突變對PCR的擴增影響較大，容易造成病毒漏檢的假陰性。而LAMP識別靶基因8個區段，在這些識別區段中個別的突變對LAMP擴增影響較小，不易產生漏檢。

4、試劑穩定、易于使用。同RPA、NASBA等技術相比，LAMP與PCR法都采用單一酶（或雙酶）系統進行反應，生產批次穩定、反應酶系統耐高溫，試劑穩定性好。在檢測試劑中僅包含酶mix一管、引物/探針一管，使用方便，在熒光定量PCR機器上可方便的進行高通量檢測。而RPA、NASBA等系統需要多個復合酶，比例嚴謹、試劑穩定生產困難、保存運輸條件苛刻、難以高通量應用。

5、LAMP法對耐受雜質能力強。PCR、RPA、NASBA等擴增體系均需要進行核酸純化制備，在進行粗制品的直擴系統中，上樣量均較小（<10%），無法大體積上樣，雜質對這些擴增方法均影響較大。而LAMP法對大多數樣本的耐受性能達到20%以上，個別樣本的含量可以容忍到50%以上，如此大的上樣體積量，決定了LAMP具有更高的檢出率。

6、擴增反應同步病毒滅活，由于LAMP反應溫度在65℃的高溫條件下進行，在病毒液直擴中，反應過程中即可滅活病毒，降低耗材的污染風險。

7、高特異性，隨著LAMP用酶不斷改進、反應緩沖液的不斷優化、探針技術的搭配、引物設計理念的不斷改善，LAMP的非特異性擴增獲得質的提升，目前在優化的LAMP體系中，假陽性的情況已經得到改善，假陽性比例接近甚至低于PCR方法。

8、多重熒光探針的應用。隨著Bst DNA聚合酶和反應緩沖體系的不斷改進、LAMP TaqMan技術的發明，多重LAMP體系得以建立。這種多重的LAMP技術，達到了金標準TaqMan PCR的多靶基因、內參質控樣本的相同性能，符合到臨床應用的標準。

恒溫擴增技術的發展現狀

自1980年PCR技術發明后，基于PCR技術的核酸檢測迅速應用到臨床、食品、環境的檢測中，并成為核酸檢測的金標準。但PCR的檢測技術存在設備體積大、粗樣品耐受性差、反應時間長、靈敏度難以達到單copy等諸多缺點，已經難以滿足現代核酸檢測的要求：速度快（<30min）、超靈敏度（1-5copy/test）、大體積粗制樣品直檢（20-50%反應體積樣本量）、野外操作、簡單化操作等方面的指標。 在過去的20年中科學家一直嘗試通過恒溫擴增的方法來實現上述目標，這其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒溫擴增技術。