細(xì)胞活化與細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程

1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。

細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：

必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

具體操作

一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二．取出凍存管：

1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

三．迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四.平衡離心：用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min

五.制備細(xì)胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：

1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。

3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

（另：冷凍細(xì)胞解凍程序）

2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它指定之成份和比例， 制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類(lèi)， 若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類(lèi)培養(yǎng)之。

2.3. 將培養(yǎng)基置于 37 °C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取 10 ml培養(yǎng)基加至 T25或 T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基， 混 合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5. 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。唯對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收到T25 flask 細(xì)胞時(shí)， 處理方式為︰

1. 于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題， 不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 °C， 并讓運(yùn)送過(guò)程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依 一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中或細(xì)胞已長(zhǎng)滿盤(pán)， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。