如何解決HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)慢及培養(yǎng)方法

HL-60細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

HL-60細(xì)胞是通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)從一名患有急性早幼粒細(xì)胞白血病的 36 歲白人女性的外周血中分離出來(lái)的早幼粒細(xì)胞。 HL-60 自發(fā)分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸（PMA，TPA）、DMSO（1% to 1.5%）、放線菌素D和視黃酸可以促進(jìn)分化。細(xì)胞表現(xiàn)出吞噬活性，并對(duì)趨化刺激有響應(yīng)。致癌基因myc表達(dá)陽(yáng)性。HL-60人急性早幼粒白血病細(xì)胞系可用于免疫紊亂和免疫學(xué)研究。

HL60細(xì)胞屬于急髓白血病M3細(xì)胞株,穩(wěn)定表達(dá)t（15，17）染色體核型以及PML融合基因，細(xì)胞總體形態(tài)為圓形，細(xì)胞膜清晰，細(xì)胞質(zhì)呈多顆粒狀。

ATCC細(xì)胞庫(kù)HL-60細(xì)胞圖片

細(xì)胞庫(kù)HL-60細(xì)胞圖片

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前開(kāi)啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺(tái)開(kāi)燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺(tái)面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭（白色0-10ul；黃色20-200ul；藍(lán)色100-1000ul）、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：IMDM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)條件

形態(tài)特征：淋巴母細(xì)胞樣，懸浮生長(zhǎng)

培養(yǎng)基: 80%IMDM+20%FBS +PS

生長(zhǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳；溫度：37℃

傳代方法：1:2至1:4，每周 3次

凍存條件：無(wú)血清凍存液（或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配），液氮儲(chǔ)存

HL-60胞收貨注意事項(xiàng)

1.收貨時(shí)需鏡下拍照（看密度、狀態(tài)）

2.靜置后需鏡下拍照（看整體密度）

a.如密度50%以下，建議換液并豎瓶培養(yǎng)

b.如密度50%-80%，建議換液培養(yǎng)，隔天觀察密度

c.如密度90%，建議傳代

3.換液及傳代處理前，培養(yǎng)瓶豎著放置至少半小時(shí)（使細(xì)胞沉到瓶底）；收集上清，必須將瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基（70ml）全部收集！并用PBS（10ml）潤(rùn)洗瓶底并收集!離心轉(zhuǎn)速為1000rpm，5min。

HL-60細(xì)胞養(yǎng)操作步驟

HL-60細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.將含有1 mLHL-60細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻；

2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后輕輕吹勻；

3.將所有HL-60細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）；

4.第二天換液并檢查HL-60細(xì)胞密度。

HL-60細(xì)胞傳代方法

如果HL-60細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

方法一：收集HL-60細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余HL-60細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

HL-60細(xì)胞凍存方法

待HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例

a.收集HL-60細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)HL-60細(xì)胞數(shù)量對(duì)應(yīng)加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

HL-60是?前已?于科學(xué)研究的?類(lèi)??病細(xì)胞系，最初是分離??名36歲的?類(lèi)?性急性早幼粒細(xì)胞??病患者。

HL-60細(xì)胞應(yīng)用特性

HL-60細(xì)胞以懸浮培養(yǎng)的形式在含有營(yíng)養(yǎng)和抗?素的培養(yǎng)基中持續(xù)增殖，倍增時(shí)間約為 36 ? 48 ?時(shí)。HL-60 細(xì)胞表現(xiàn)出嗜中性早幼粒細(xì)胞（neutrophilic promyelocyticmorphology） 形態(tài)，隨后進(jìn)?的評(píng)估則指出其出?成熟的急性?髓性??病。HL-60細(xì)胞通過(guò)在細(xì)胞表?表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋?及胰島素受體進(jìn)?增殖。如果從??清培養(yǎng)基中除去轉(zhuǎn)鐵蛋?或胰島素受體其中?項(xiàng)， HL-60 細(xì)胞的增殖就會(huì)?即停?。通過(guò)?甲基亞砜或維A酸的化合物，可以誘導(dǎo)其分化為成熟的粒細(xì)胞;??化三醇、佛波醇-12-?四烷醯-13-?酸酯及顆粒??球-巨噬細(xì)胞集落刺激因?等的化合物，則可以分別誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞樣或嗜酸性粒細(xì)胞表型。

HL-60細(xì)胞系科研用途

HL-60細(xì)胞可以?作研究?理學(xué)、藥理學(xué)和病毒學(xué)因素對(duì)髓樣分化的影響。HL-60細(xì)胞模型已經(jīng)應(yīng)?于研究DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 IIα 和 IIβ 對(duì)細(xì)胞分化和凋亡的影響，并且特 別適?于介電泳研究。此外，研究?員已使?HL-60細(xì)胞來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)的鈣是否在活性氧誘導(dǎo)的胱天蛋?酶激活中發(fā)揮到作?。HL-60細(xì)胞及衍?的分化細(xì)胞，它們的染?質(zhì)和基因表達(dá)譜研究是近年進(jìn)?的研究。

如何養(yǎng)好HL-60細(xì)胞經(jīng)驗(yàn)分享

1.細(xì)胞形態(tài)觀察。細(xì)胞膜是每天必須觀察的，看是否清晰, HL60細(xì)胞的死亡往往是從細(xì)胞膜的破裂開(kāi)始的，早期的表現(xiàn)就是細(xì)胞膜某一點(diǎn)出現(xiàn)欠完整或者毛發(fā)影。

2.HL-60細(xì)胞在高密度下?tīng)顟B(tài)比較好，細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)會(huì)吸收一些細(xì)胞碎片；

3.低密度時(shí)細(xì)胞狀態(tài)很差，傳代比例要控制，當(dāng)培養(yǎng)密度達(dá)到1x106/mL左右時(shí)可傳代，細(xì)胞狀態(tài)不好時(shí)后面?zhèn)鞔梢圆挥秒x心；

4.DMSO會(huì)對(duì)HL-60刺激分化，建議復(fù)蘇馬上離心去除DMSO；

5.懸浮細(xì)胞對(duì)血清要求高，選用優(yōu)質(zhì)血清培養(yǎng)；

6.培養(yǎng)過(guò)程中盡量不動(dòng)或少動(dòng)培養(yǎng)瓶。

7.HL60細(xì)胞往往會(huì)有"抱團(tuán)" 現(xiàn)象，抱團(tuán)生長(zhǎng)或死亡，勤換液或傳代，盡量避免細(xì)胞抱團(tuán)。

8.HL60細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，強(qiáng)烈建議用較大的培養(yǎng)瓶養(yǎng)，用小瓶養(yǎng)的話，換液不及時(shí),很容易死亡。HL60細(xì)胞的生長(zhǎng)速度一般為2天左右就需要傳代。

9.HL60細(xì)胞對(duì)胎牛血清高度依賴。培養(yǎng)液PH應(yīng)調(diào)為7.20-7.40之間。

10.防污染。HL60細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，較少發(fā)生污染，但常規(guī)措施應(yīng)該做好。比如無(wú)菌操作，酒精消毒等，培養(yǎng)瓶口建議過(guò)火，包括瓶蓋，應(yīng)過(guò)火4秒左右。

11.凍存。-20℃小時(shí), -80℃過(guò)夜，液氮長(zhǎng)期保存。強(qiáng)烈建議液氮長(zhǎng)期保存，盡量不要在-80℃長(zhǎng)期保存，死亡率很高。

12.復(fù)蘇。調(diào)節(jié)水浴箱溫度為42°C，并提前在試管內(nèi)放置10倍培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液溫度與室溫一致。1分鐘內(nèi)融化細(xì)胞（禁止搖晃凍存管），移取至試管內(nèi)，動(dòng)作要輕，從試管管底開(kāi)始慢慢，上提移液管，使細(xì)胞在培養(yǎng)液內(nèi)分布均勻，離心，洗2次。

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

1.HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)慢、狀態(tài)差怎么辦

當(dāng)細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)速度慢且狀態(tài)不佳時(shí)，可豎著培養(yǎng)直到培養(yǎng)基變黃，待細(xì)胞密度起來(lái)后，狀態(tài)會(huì)有所好轉(zhuǎn)。

同時(shí)，若HL-60細(xì)胞狀態(tài)很差，可采用半換液的方式：

以T25瓶子為例，瓶子里有5mL培養(yǎng)基，豎起瓶子靜置一段時(shí)間（豎瓶前拍拍瓶子，讓輕貼底部的細(xì)胞團(tuán)浮起來(lái)），待細(xì)胞沉底（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況），小心吸出2.5mL的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000rpm 3~5min，用2.5mL新鮮培養(yǎng)基重懸后再放回原瓶。

2.HL-60細(xì)胞什么時(shí)候傳代

HL-60細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，

3.HL-60細(xì)胞貼壁嗎

HL-60細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，不是貼壁細(xì)胞。

4.HL-60細(xì)胞用什么培養(yǎng)基

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)基是80%IMDM+20%FBS +PS

5.HL-60細(xì)胞致瘤嗎

Yes, in nude mice（subcutaneous myeloid tumors） .Yes，in semi-solid media。

6.HL-60細(xì)胞受體表達(dá)情況

complement, expressed;Fc, expressed。

7.HL-60細(xì)胞基因表達(dá)情況

tumor necrosis factor （TNF），also known as tumor necrosis factor alpha（TNF-alpha, TNF alpha），after stimulation with phorbol myristic acid, myc+。

8.HL-60細(xì)胞的推薦接種密度是多少

ATCC 建議在補(bǔ)充有 20% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清的 IMDM中以 1.0-2.0 x 10 5 個(gè)活細(xì)胞/ml 的密度接種。這些細(xì)胞通常會(huì)從冷凍保存中緩慢恢復(fù)并作為單細(xì)胞懸浮液生長(zhǎng)。HL-60細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，只需每 2 或 3 天培養(yǎng)瓶中添加一些新鮮培養(yǎng)基即可。應(yīng)經(jīng)常進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確保細(xì)胞密度不超過(guò) 1 X 10 6 個(gè)細(xì)胞/ml。