培養NK-92/NK-92MI細胞時要注意什么？

NK-92細胞，是從外周血單核細胞衍生來的、IL-2依賴型NK細胞株。

NK-92MI細胞，源自NK-92細胞的IL-2非依賴的NK細胞株。

親本細胞NK-92通過微粒體基因轉化法，用逆轉錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進行轉化。

作為同源細胞，NK-92與NK-92MI細胞存在諸多共性，但二者在培養方式及注意事項上也不盡相同。

下面，小普將為同學們詳細闡釋，NK-92MI與NK-92細胞的收貨以及培養注意事項。

01

細胞收貨注意事項

除NK-92 細胞在分瓶后需添加IL-2之外，NK-92MI與NK-92細胞在收貨處理上，方法大致相同。具體操作如下：

細胞剛收到后，將細胞培養瓶先豎立靜置2~4個小時，讓細胞沉降到底部；

大細胞靜置完后，將瓶中上面部分培養基小心吸出，留底部細胞和3ml左右培養基在原瓶；

吸出的細胞培養基離心收集細胞沉淀，離心轉速1000轉3分鐘，或根據您的離心機實際情況而定，轉速不宜過高；

將得到的細胞沉淀，用2~3ml NK-92/NK-92MI完培重懸后，放回原瓶繼續培養過夜，一個T25最終培養體積是5~6毫升；

NK-92細胞可按照200 U/ml的濃度補加一點IL-2，因為原瓶留的培養基IL-2可能已部分失效，NK-92MI細胞則不需要額外補加IL-2。

出廠的培養瓶為不透氣瓶蓋，一定要擰松到不掉的程度，使細胞充分透氣；

培養瓶橫放，瓶口擰松透氣，培養過夜；

第二天，視細胞密度和培養基消耗情況，進行分瓶。不建議直接進行離心操作，因為經過運輸顛簸和各種處理，細胞很可能達不到狀態。盡量不要吹散細胞團，加完液輕晃培養瓶即可。

02

細胞培養注意事項

NK-92MI與NK-92細胞同源，在培養方法上也有很多共同之處。但由于兩者對IL-2敏感程度不一，培養操作時略有差別。具體步驟如下：

NK-92與NK-92MI細胞都為懸浮生長，大部分細胞聚集成團，少數細胞分散，并且細胞間隙會有較多的死細胞和細胞碎片；

NK-92細胞對IL-2敏感。培養基中IL-2降解，將導致細胞狀態變差。IL-2在-20℃解凍后置于4℃冰箱保存，4℃保存不應超過兩周。配制好的新鮮培養基要盡快用完，建議每次使用前拿出來常溫預熱，不要放培養箱預熱，使用完畢后放回4℃冰箱保存；

實驗室常備IL-2，發現細胞狀態不好、散在細胞變多、細胞不生長等情況，以200 U/ml的濃度添加IL-2，培養2-3天后即可恢復狀態；

NK-92MI細胞雖然對IL-2不敏感，正常培養不需要補加IL-2，但如果發現細胞狀態不太好，散在細胞變多，細胞不生長等情況，也可以以200U/ml的濃度補加IL-2，培養2-3天后狀態會有改善。

NK-92與NK-92MI細胞都對離心敏感。正常培養時，換液周期為2~3天，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次后，離心全量換液一次。盡量減少離心次數，細胞狀態不佳或細胞量少的時候，一般不建議離心；

換液方法：

? 補液法：每2~3天補加適量（根據培養容器和原來細胞懸液體積來定，T25瓶一次補液1~2毫升即可）新鮮培養基（NK-92需要同時補加200 U/ml IL-2，而NK-92MI則不需要），補加2-3次之后，離心全部換液。

? 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養基）為例，豎起瓶子靜置一段時間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細胞團浮起來），待細胞沉底（肉眼觀察細胞沉底情況），小心吸出2.5ml上清轉移到離心管，離心1000rpm 3~5min，離心后的細沉淀用2.5ml新鮮培養重懸后放回原瓶繼續培養。

細胞生長時，聚集的細胞團會逐漸增大，正常的細胞團在顯微鏡下呈現白色透亮狀。若細胞聚集太多，出現細胞團中部發暗時，可傳代；

傳代方法：

? 將細胞團用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可過大，否則會出現大量死細胞和細胞碎片），均分到兩個瓶子里，每瓶再補充等量培養基。

細胞對營養要求很高，千萬不能團塊太大，這會導致營養不足；細胞團塊過大時，需要稍微吹散，注意控制吹打次數，不需要全部吹散。

03

細胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比，NK-92細胞可適量補加IL-2，NK-92MI無需添加；

細胞凍存的時候，盡量吹散細胞，注意控制吹打力度。

04

細胞復蘇

NK-92MI與NK-92細胞的復蘇培養方法相同，操作步驟如下：

復蘇后，用5ml新鮮培養基，重懸細胞；

瓶子豎著（瓶蓋朝上）放進培養箱，以增加細胞局部密度，瓶蓋保持透氣；

細胞生長需要穩定的環境，可每天觀察1次，不要頻繁拿出培養箱觀察；

每3天補液一次，補充1-2ml新鮮培養基即可，補加1-2次之后半量換液，不要頻繁離心；

觀察到培養基明顯變黃，細胞團塊明顯變大后可以分瓶，一次傳代最多分一瓶同等大小培養瓶。

05

 細胞團塊是否需要吹散

減少離心次數，控制傳代時的吹打次數。團塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；

正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數以及力度，即使細胞都分散成單個，也會在1~2天內聚集起來；

細胞團太大時，需要分散；

細胞凍存的時候，細胞需要盡量分散，否則影響凍存效果。