總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒 (NBT核黃素比色法)説明書

總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒

(NBT核黃素比色法)

一、產品簡介：

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發生岐化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內一種重要的抗氧化酶；由于超氧自由基是不穩定的的自由基，壽命極短，SOD活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應來測定SOD活力，其中顯色劑有NBT(四氮唑藍)、WST-1、WST-8等。

雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應，通過比色來檢測組織、細胞、植物、血清或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒，其檢測原理是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化合物存在的情況下，核黃素被光還原，后經一系列的反應可將NBT還原為藍色的甲臜(formazan)，后者在560nm處有強吸收，SOD可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲臜的形成，反應液藍色愈深說明超氧化物岐化酶活性愈低，反之則酶活性愈高，據此通過比色分析就可以計算出超氧化物岐化酶活性水平。

該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

二、產品組成：

三、自備材料：

生理鹽水或PBS

離心機、離心管、小試管

分光光度計、比色杯

水浴鍋或恒溫箱

四、操作步驟(僅供參考)：

1、 準備樣品：

①血漿或含紅細胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應有溶血，如果含有應去除紅細胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少500μl全血，4℃ 3000g離心5min，轉移上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測；亦可采用紅細胞裂解液去除紅細胞，如Leagene ACK紅細胞裂解液等。

②組織樣品：動物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。

③細胞樣品：對于貼壁細胞，由于后續用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞。可以使用細胞刮或EDTA處理細胞并收集細胞，細胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次，按照每10⁶細胞加入300～500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。

④植物樣品：準確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于4℃預冷的研缽或勻漿器中，加入預冷提取液1ml，低溫研磨至勻漿后轉移至離心管，用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉入離心管，加提取液至總體積為4ml，4℃ 10000r/min離心20min，上清液為酶提取液，上清液可用于SOD的檢測。注意：如果SOD酶活性較低，應相應減少提取液的總體積，以便提高SOD酶的濃度。

⑤上述樣品準備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，通常10-20μg蛋白的細胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準備20～100μg蛋白量通常已經足夠用于后續檢測，根據蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用該試劑盒提供的SOD提取液適當稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10～100倍，準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當天完成測定。

2、 配制NBT酶工作液：按照每個反應1.6ml的體積，均勻混合1ml SOD提取液、0.3ml NBT顯色液、0.3ml酶溶液，即可配置成1.6ml NBT酶工作液，根據待檢測樣品(包括標準品)的數量，配置適量的NBT酶工作液。具體配置方法可以參考下表，配制好的NBT酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現配現用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當混勻后再使用。

3、 (選做)準備SOD標準品：需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的SOD提取液將SOD標準品稀釋至如下系列濃度：200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取20μl參考樣品進行檢測。注意：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標準品宜現稀釋現使用，該試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標準品，但可使用SOD標準品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考

4、 SOD加樣：參考下表使用小離心管或試管設置空白對照管、光照對照管、測定管。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入反應啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應啟動工作液后反應即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應啟動工作液的時間先后差異而導致的誤差。

5、 SOD測定：混勻，取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應20min，各管受光情況應一致，溫度高時時間縮短，低時延長；反應結束后以不照光的空白對照管調零，用分光光度計或酶標儀測定560nm處吸光度，如果用分光光度計，比色杯光徑1cm，加入的上清量因根據比色杯的最小量程而定。

五、計算結果：

SOD活力單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U)。

液體中總SOD活力(U/ml)=(A_光照－A_測定)/(50%×A_光照×V_T)

組織、細胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A_光照－A_測定)×V/(50%×A_光照×V_T×W)

血液中總SOD活力(U/gHb)=(A_光照－A_測定)×V×C/(50%×A_光照×V_T×Hb)

式中：A_光照=光照對照管的吸光度

         A_測定=測定管的吸光度

         V=樣品液總體積(ml)

          V_T=測定時樣品所用體積(ml)

          W=樣品鮮質量(g)

          C=1ml/采血量(ml)

          Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)

六、注意事項:

1、 上述低溫試劑避免反復凍融，以免失效或效率下降。

2、 待測樣品-70℃可保存1個月，需注意反復凍融會導致SOD部分失活。

3、 細胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，否則會干擾本試劑盒的檢測。

4、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。

5、 對于植物樣品，研磨處理應迅速，以免SOD酶活下降，盡量處于冰浴狀態處理。

6、 如果無4000Lx日光，可200W在10~12cm處垂直照射20min；在超凈工作臺5cm垂直照射30min左右；在強太陽光下垂直照射30min左右。

7、 一般要求各管受光情況一致，所有反應管應排列在與日光燈管平行的直線上。

8、 反應溫度控制在25℃，視酶活性高低適當調整反應時間；溫度較高時，光照時間應縮短；溫度較低時，光照時間相應延長。

9、 所用離心管或試管應潔凈透明，透光性好。

10、 如果配制的NBT酶工作液出現淡黃色沉淀或絮狀物應棄用，否則效果不佳。

11、 如果用酶標儀，96孔板每孔應加20μl上清液，相應檢測的次數大大增加。

12、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

七、有效期∶6個月有效。