小鼠β氨基己糖苷酶A elisa試劑盒如何操作培養(yǎng)

產(chǎn)品名稱：小鼠β氨基己糖苷酶A(β-hexosaminidaseA)Elisa試劑盒

指標(biāo)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入指標(biāo)，再與HRP標(biāo)記的咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中指標(biāo)濃度。

標(biāo)本

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟:

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

ELISA的檢測目的是為了實驗提供準(zhǔn)確的實驗依據(jù)，為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性，在實驗過程中必須堅持全面的質(zhì)量控制和全過程質(zhì)量控制，在收集標(biāo)本前都必須有一個完整的計劃

注意事項

1、每個樣本量收集體積=100ulx檢測種類，如果要做復(fù)孔，標(biāo)本量收集體積=100ulx檢測種類x2
2、樣本收集后若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測可保存于2-8°C，若不及時檢測，請進(jìn)行分裝，凍存于-20°或-80°C，避免反復(fù)凍融
3、試劑盒的檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本。
4、血清標(biāo)本采集是應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解是會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色
5、為了保證尿液檢測的準(zhǔn)確性，必須正確收集尿液標(biāo)本和保存，收集尿液的容器必須要清潔干燥， 使用一次性的容器，避免因用藥并清潔不到而造成的污染，尿液樣本必須新鮮，留取后，應(yīng)及時檢測或保存
6、標(biāo)本宜在新鮮是檢測如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。如在冰箱中保存過久，其中可能發(fā)生聚合，間接法ELISA中樂視本底加深，
7、反復(fù)凍融會使蛋白效價降低，所以待測樣本如需多次檢測，宜少量分裝凍存

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月